臨床上，病毒的感染需要進行診斷，才能提供醫(yī)師治療的依據(jù)、流行病學的訊息以及病毒感染的防治。病毒的實驗室診斷方法 包括以養(yǎng)殖細胞分離病毒、組織學、血清學、電子顯微鏡觀察、免疫分析以及核酸 (DNA 或 RNA)偵測等方法[1-2]，操作這些方法前， 須從疑似病毒感染的患者適當?shù)牟课徊杉?種檢體，并盡速運送至檢驗室進行實驗室診 斷[2]。病毒感染的診斷準確性受到各種因子。

 

影響:(i)檢體的采檢時機:檢體通常在癥狀 出現(xiàn)后的 3 天內(nèi)采檢;(ii)采檢部位的選擇: 如呼吸道感染，選擇利用拭子(swab)采集呼 吸道檢體;(iii) 檢體的方式:如采檢體液或 利用拭子采檢后放入無菌的空容器、小瓶(vi- als)或裝有液體運送培養(yǎng)基(transport   medium)的容器(如試管);(iv)采檢的拭子的本質(zhì):拭子的材質(zhì)以植絨(flock)材質(zhì)為佳[2-3]，并具 有塑料或鋁材質(zhì)的硬柄或軟柄，不可使用木 柄的棉棒，因其對養(yǎng)殖細胞具有毒性;也不 可使用海藻酸鈣(calcium alginate)成分的拭 子，因其對含包膜 (envelope) 的病毒具有毒 性、并可干擾熒光抗體試驗以及抑制一些核 酸物質(zhì)而影響核酸的分子生物檢測;(v)檢體 的運送時間、儲存環(huán)境以及  (vi)   其它:如采集技術、采集的檢體量、檢體標示以及患者的臨床信息等[1,3]。有些病毒感染的實驗室診斷是必要的， 例如檢測會引起嚴重癥狀的病毒[如后天免疫 缺 乏 癥 候 群 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的艾滋病毒(HIV)]或是長期 的潛伏的病毒〔如長期潛伏于肝臟的 B 型肝 炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)和 C 型肝炎 病毒(Hepatitis C virus, HCV)J;或在短時 間內(nèi)能快速傳播及引起高致死率的病毒，如:2003 年爆發(fā)流行的  SARS  病毒(SARS-CoV)[4]及 2019 年爆發(fā)流行的新型冠狀病毒(SARS- CoV-2,  COVID-19 病毒)[5]。此外，已經(jīng)有 藥物可以治療的病毒感染，或為了流行病學 調(diào)查、醫(yī)院感染控制、公共衛(wèi)生如隔離等目 的而進行檢體的采集并進行各類病毒的檢測。 病毒檢測檢體除了體液〔如支氣管肺泡 灌洗(BAL)、腦脊髓液(CSF)、尿、血液J外， 若以拭子采集的檢體需放入空的無菌容器或 含有運送培養(yǎng)基的容器內(nèi)，立即以適當?shù)臈l件送至檢驗室或儲存在適當?shù)沫h(huán)境一段時間再送至檢驗室。因此，病毒檢測檢體中的抗 原、活性、病毒量與核酸將受到拭子的本質(zhì)、運送培養(yǎng)基的成分、運送的條件、儲存的時 間與環(huán)境等之影響[1,3]。為了保存病毒的活性 以及核酸，檢驗室有必要使用良好質(zhì)量與材 質(zhì)的拭子以及適當?shù)臋z體運送培養(yǎng)基種類。

對少數(shù)引起嚴重疾病的病毒而言，檢測 病毒必須在 P2+或 P3 甚至 P4 等級的負壓實驗室中進行，以 SARS-CoV 及 SARS-CoV-2而言，更是如此。然而，有此些安全等級的 實驗室在醫(yī)院中并不普遍，因此，對高傳染 性的病毒而言，整體的檢驗能量將受到限制。 在 SARS-CoV-2 疫情期間，增加全國的檢測 能量以早期偵測感染或潛伏的患者將有其重 要性及必要性。對不進行病毒分離培養(yǎng)而僅 提供核酸擴增試驗的檢驗室而言，只要檢測 檢體先經(jīng)去活化   (inactivate，滅活)處理，則

檢測的場所僅需在 P2  等級的實驗室即可進行操作，如此，將可擴展全國對   SARS-CoV-2病毒的整體檢測能量。

在臺灣，具有病毒檢測能力的檢驗室雖 有能力配制一般病毒檢體的運送培養(yǎng)基，但 其使用前大多未進行實用的效能評估或進行 效能的品管，且常沒有使用正確材質(zhì)成分的 拭子，有鑒于此，做新生物科技公司開發(fā)兩 種病毒檢測檢體的運送裝置:一為 CMPTM 病 毒運送保存管[viral transport medium (VTM)]，另一為 CMPTM 去活化型病毒運送保存管[in- activated  viral  transport  medium  (I-VTM)](圖 1A)，兩者皆可搭配鼻咽及/或口咽植 絨拭子(flocked swab)。植絨拭子皆具有斷點 (圖 1B)，可將拭子前端折進運送管內(nèi)。為 了了解 VTM 與 I-VTM 輔助病毒(包含 SARA- CoV-2)偵測的效能，有必要以適當?shù)牟《?進行實用性評估。

早期，對于運送檢體裝置的病毒回收率 并沒有標準的方法，只有少數(shù)的研究從臨床上取得的檢體，經(jīng)由不同運送裝置來比較病毒的回收率;或是添加某種病毒檢體至運送 裝置，檢視回收率。為了將運送培養(yǎng)裝置的評估加以標準化，Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M40-A2[6]提出明 確規(guī)范，包括病毒檢體的種類、運輸時間、 保存溫度及病毒接種濃度上限范間。在規(guī)范 中，將裝置保存在指定溫度，仿真運輸時間 (24、48、72   及   96   小時)，再分別制備十倍連續(xù)稀釋液，吸取 0.2  mL 接種至養(yǎng)殖細胞中，若產(chǎn)生細胞病變效應(cytopathic effects, CPE)，代表病毒具有活性，即運送裝置保存 病毒的性能符合規(guī)范之要求。

本研究將根據(jù) CLSI 建議選用第二級病毒[6]之一的腸病毒 71 型(Entrovirus  71,  EV  71)進行測試，EV 71 屬于微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)，不具包模(envelope)的單股 正股 RNA 病毒，由于不具包膜，對于環(huán)境的耐受力較高[7]，且其與冠狀病毒科(Coronavi-ridae)中的 SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 皆屬 于 RNA 病毒[4-5]。實驗時，將 EV 71 分別與 VTM 或 I-VTM 兩種運送培養(yǎng)基混合，保存于 三種溫度，然后于不同指定時間后，分別接 種至人類橫紋肌肉瘤細胞(human rhabdomyos- arcoma cell , RD 細胞)中，之后觀察 CPE 及利用反轉錄-實時聚合醋鏈反應(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)偵測 RD 細胞內(nèi) EV  71 之正股及負股 RNA，其中細胞內(nèi)正股 RNA 代表 EV  71 成功感染細胞，而細胞內(nèi)負股 RNA 則為 EV 71 復制其 RNA 的中 間產(chǎn)物，可間接證明 EV 71 于 RD 細胞內(nèi)復 制。另外，本研究利用 SARS-CoV-2 的三對 基因[8-9]分別與 VTM 或 I-VTM 混合，亦進行 如同 EV 71 在不同保存溫度及時間條件下的 qRT-PCR 檢測，以了解此 VTM 及 I-VTM 保 存 SARS-CoV-2 核酸的能力。

 

 

非洲綠彌猴腎細胞株 (vero cell line, ATCC CCL-81)及 EV 71 (BrCr, ATCC VR784)均購自食品工業(yè)發(fā)展研究所，臺灣。SARS-CoV-2 的三對引子(primers)基因片段 (E gene、RdRp gene 及 N gene)，購自 MicroBioLogics?(型 號:   HE0062S)，USA。試劑與藥品一倍基本培養(yǎng)液 (1x minimal essential medium, MEM)與抗生素(antibiotic-antimycin, 內(nèi)含 penicillin、streptomycin、amphotericin B)購自 Corning Incorporated 公司，美國。胎 牛血清(fetal bovine serum, FBS)、膜蛋白酵 素(Trypsin)與一倍磷酸鹽緩沖液(1x phosphate buffer saline, PBS)來自 GE Healthcare 公司， 美國。甘油(Glycerol)、氯仿(chloroform)、 75% 酒精 (EtOH)、異丙醇 (isopropanol) 與 DEPC (diethylpyrocarbonate)處理水從 Merck 公司(德國)取得。熒光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)則購自 Roche 公司，瑞士。而 cDNA 反轉錄試劑盒 (High- Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)及 trizol(分離 RNA、DNA、蛋白質(zhì)的試劑) 則來自 Thermo Fisher Scientific 公司，美國。

細胞培養(yǎng)液配制(10%  MEM、2%  MEM)取總體積 10%的 FBS 及 1%的抗生素的 加入 1x MEM，此為生長培養(yǎng)液(10% MEM)， 存放于 4C用于細胞繼代及培養(yǎng)。取總體積 2%的 FBS 及 1%的抗生素加入 1x MEM，此 為維持培養(yǎng)液(2% MEM)，存放于 4C用于稀 釋藥物及維持受病毒感染的細胞株。FBS 使 用前需在 56C水浴槽加熱 30 分鐘，去除血 清中補體，分裝后保存于-20C備用。將 10x PBS 利用去離子蒸餾水  (double-distilled H2O, ddH2O) 稀釋成 1x PBS，再經(jīng)滅菌冷卻后存 放于 4C備用。此外，glycerol 則以 ddH2O 稀 釋成 30%   glycerol，再經(jīng)滅菌冷卻后，存放于 4C備用。

        RD  細胞培養(yǎng)/繼代培養(yǎng)

RD 細胞于培養(yǎng)瓶中生長至 80%時，進 行繼代培養(yǎng)。在無菌操作箱(型號:Revcoeite II)中，將經(jīng)過培養(yǎng)的 T25 培養(yǎng)瓶(購自 Corning Incorporated 公司，美國)以 3 mL 1x PBS 潤洗后去除培養(yǎng)液，接著加入 0.5 mL Trypsin， 混合均勻后置入 37C之 5% CO2 培養(yǎng)箱中放 置 1 分鐘，取出培養(yǎng)瓶后以拍擊方式震散細 胞，然后加入 4.5 mL 10% MEM 以中和 Trypsin 的繼續(xù)作用，將 RD 細胞沖下并均勻 打散，接著將細胞與 10% MEM 以 1:4 至 1:9 的比例回種到新的細胞培養(yǎng)血中，置于 37C 之 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

EV  71 之溶斑試驗

利用溶斑試驗(plaque assay)測定 EV 71 濃度，實驗時，將 RD 細胞培養(yǎng)于 6 孔細胞 培養(yǎng)盤中，之后以 2% MEM 將待測病毒液進 行連續(xù) 10 倍稀釋后 (10-2-10-6)進行感染，其 中 1 孔為不加病毒液之陰性控制組，將細胞 置于 37C的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 1 小時進行感 染。

于感染的過程中，配制等體積的 1.2%瓊 脂溶液與 2x 培養(yǎng)液，置于 44C水浴中。待病 毒感染完成后去除病毒液，將等體積之 1.2% 瓊脂溶液與 2x 培養(yǎng)液均勻混合后，分別于培 養(yǎng)盤中每一孔緩慢加入 4  mL 瓊脂培養(yǎng)液，待凝固后，置于 37C的 5% CO2 培養(yǎng)箱中，于3  天后加入第二層瓊脂，然后繼續(xù)培養(yǎng)。

當產(chǎn)生明顯 CPE 時(通常于感染后第 5 天)，于每培養(yǎng)盤中每孔加入 1 ml 3.7%甲 醒，于 4C固定。隔天輕輕敲除 6 孔盤中的 瓊脂培養(yǎng)基，并加入 2-3 滴的 0.5%結晶紫，染色 5 分鐘后，以清水沖洗干凈。當培養(yǎng)盤完全干燥后，受到 EV  71 感染的 RD 細胞由 于死亡脫落而無法被染上色，形成肉眼可見的空洞，稱為溶斑(plaque)。藉由感染不同稀 釋倍數(shù)的病毒液所造成的溶斑數(shù)目推算原始 病毒的效價 (titer)，單位為 plaque forming unit (PFU)/mL，代表每 mL 病毒液可產(chǎn)生的 病毒溶斑數(shù)目。

 

EV 71 RNA 之萃取

將 1.5 mL 含有 EV 71 的培養(yǎng)液于 4C下1,000 rpm，離心 5 分鐘，將上清液去除后加 入 1 mL 的 trizol 將沉淀物打散，將混合液移 至另一個 1.5  mL 微量離心管中，于室溫靜置 5 分鐘，接著加入 200 μL chloroform，利用 振蕩器(vortex genie 2)震蕩 1 分鐘，直至溶 液顏色變成粉紅色后，然后再于室溫靜置 2-3 分鐘。將離心管于 4C，12,000   rpm 離心 15

分鐘后，小心吸取上層含 RNA 之透明液(至少 450 μL)移至新的 1.5 mL 微量離心管中， 然后加入 0.5 mL isopropanol 后，上下?lián)u晃 約 10 次，將溶液混合均勻后，靜置于室溫 10 分鐘，接著將離心管于 4C，12,000 rpm  離 心 10 分鐘后去除上清液后，再加入 1 mL 的 75% EtOH 于 4C，12,000 rpm 離心 10 分鐘 后小心去除上清液，將白色沉淀物(pellet)風 干至半透明后加入 20 μL DEPC 處理水回溶 沉淀物，將樣本置于冰上以測定 EV 71 濃度。

反轉錄-實時眾合 鏈反應(quantitative reverse transcription  PCR,  qRT-PCR)反轉錄

PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)[9]:

將萃取出之 EV  71  RNA 以 20μL DEPC 處理水 20 倍稀釋，使用超威量分 光亮度計(ND-1000, NanoDrop Spectrophotometer) 測量其濃度。然后根據(jù)測得的濃度，加入 1 μg 濃度 RNA、2 μL 10x RT buffer、0.8 μL 25x  dNTP  Mix  (100  mM)、2  μL  10x  RTrandom primers、1 μL MultiScribeTM reverse transcriptase 及 1 μL RNase inhibitor 之后補ddH2O 至總體積 20 μL，再以 25C保持 10 分鐘、37C保持 120 分鐘、最后 85C保持 5 分 鐘的順序循環(huán) 1 次，進行 RT-PCR。

qPCR   之操作流程[10]:將萃取出的   EV 71 RNA 進行反轉錄聚合醋鏈反應，得到的 cDNA 后進行 qRT-PCR 檢測。取 5 μL cDNA、0.5 μL Forward primer (30 M)、0.5 μL Reverse primer (30   M)、25 μL FastStart Universal SYBR Green Master 及 19 μL ddH2O 置 入 StepOnePlusTM real-time-PCR 儀 器 (Thermo Fisher  Scientific  公司，美國)中 擴增 40 次進行量測，利用 StepOnePlusTM 之 內(nèi)建軟件進行熒光偵測，再將偵測到的訊號 轉換為數(shù)值，并以 GAPDH 為內(nèi)部控制組， 將各組待測基因之 CT 值標準化以取得企CT 值，而后實驗組扣除控制組之企CT   值，得到企企CT。2-企企CT   則可表示不同組別之待測基因與控制組之基因相對表現(xiàn)量。

         Primer: EV 71 RNA Positive  strand

         F:   (GAGAGTTCTATAGGGGACAGT)

         R:  (AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA) Negative  strand

         F:   (ACTGTCCCCTATAGAACTCTC)  

         R:  (TTCCTAATTCACATAGCACAGCT)

 

VTM 與 I-VTM 的效能評估

效能評估時，將 EV 71 分別與 VTM 或 I- VTM 混合，然后保存在 3 種溫度，在不同保 存時間后接種 RD 細胞， 觀察 EV 71 的活性 (有能力產(chǎn)生 CPE)以及偵測核酸的存在(能被 qRT-PCR 方法檢出)。根據(jù) CLSI M40-A2 建 議的病毒檢體運送裝置評估標準[6]，本研究使 用的 EV 71 原液濃度為 1x106 PFU/mL，在 保存型 VTM 組別中將培養(yǎng)基中病毒濃度稀釋 至 2x105 PFU/mL，取 0.2 mL 病毒加入 2 mL VTM 中(約  1.8x104     PFU/mL);另外 I-VTM 組別，取 50 L 病毒與 50 L I-VTM 混合后 放入離心管中   (約 5x105     PFU/mL)。個別在4C、-80C及室溫存放。由于在臺灣，交通 運送便利且距離較近，病毒檢體運送時間短， 且通常存放在 4C。所以在 4C組別中增加 6 小時及 24 小時兩個組別，以仿真病毒檢體實 際運送狀況。保存在 4C分為 6、24、48、72 及 96 小時共 5 組，而保存在-80C及室溫為48、72 及 96 小時共 3 組。此外，為了確認 I-VTM 裂解病毒的能力，額外將 EV 71 接種于 I-VTM 中存放 10 分鐘、30 分鐘、1、2、3 及 4 小時，然后接種 RD 細胞并觀察 CPE。

當 EV 71 接種至 VTM 存放至預設的時 間點后，VTM 組別分別取 0.2 mL(約 103 PFU)接種至 RD 細胞中，再加入 0.2 mL 2% MEM 進行混合，而 I-VTM 組別則取 40 L， 加至 9.96  mL  2%  MEM，稀釋后(約 2x103PFU/mL)取 1 mL(約 2x103  PFU)接種至RD 細胞中。隨后，將接種 EV 71 的 VTM 及I-VTM 組別分別放置于 37C之 5% CO2 培養(yǎng) 箱培養(yǎng)中，1 小時后，移除細胞培養(yǎng)液，以 1x PBS 潤洗過后，再加入 2% MEM，然后 分別培養(yǎng) 48 及 72 小時，最后以倒立式顯微 鏡觀察 CPE。同時，將只加入 VTM 或 I-VTM 作為保存液之 RD 細胞及含有 2% MEM 的 RD 細胞分別作為陰性控制組。培養(yǎng)至指定時間 后，分別觀察 RD 細胞的 CPE 及操作 qRT- PCR 以分析 VTM 或 I-VTM 的效能。

 

VTM 或 I-VTM 保存 EV 71 與 SARS-CoV-2

核酸的測試

為了確認 EV 71 與 SARS-CoV-2 的 RNA 可以直接保存在 VTM/I-VTM 中，本研究分 別取 1 L EV 71 (1x106 PFU/mL) 加至 1 mL VTM 或 I-VTM 中(約 1x103    PFU/mL)，以及取 10 uL SARS-CoV-2 檢測所用的 E、 RdRp 及 N 基因片段之混和庫存液(mix stock)，分別保存在 4C、-80C及室溫，然后存放至24 及 96 小時，最后再抽取兩種病毒之核酸進行 qPCR 檢測。

 

結    果

 

在不同溫度及時間下 VTM 保存 EV 71 活性與 核酸的狀況

本研究將 EV 71 保存于 VTM 中，然后 于特定的時間點時移種至 RD 細胞中進行培 養(yǎng)，經(jīng)過 72 小時后觀察細胞形態(tài)，并與未接 種 EV 71 之 RD 細胞進行比較。相較于控制 組，無論在 4C、室溫及-80C，RD 細胞皆 呈現(xiàn)皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、凝聚、和脫落 等現(xiàn)象(圖 2A)，此結果顯示 RD 細胞發(fā)生 CPE(表 1)，代表 EV 71 具有活性。另外， qRT-PCR 檢測 RD 細胞內(nèi) EV 71 之正股與負 股 RNA 片段，結果皆呈現(xiàn)陽性(表 1)，此 指出 VTM 可良好保存病毒之核酸。

在不同溫度及時間下 I-VTM 去除 EV 71 活性 與保存 EV  71 核酸的狀況

本研究將 EV 71 保存于 VTM 中，然后 于特定的時間點時移種至 RD 細胞中進行培 養(yǎng)，經(jīng)過 72 小時后觀察細胞形態(tài)，并與未接 種 EV 71 之 RD 細胞進行比較。結果顯示在 4C、室溫及-80C細胞皆無 CPE(圖 2B)。 同時利用 qRT-PCR 檢測細胞內(nèi) EV 71 正股及

負股 RNA 片段，觀察細胞內(nèi)病毒核酸保存情形，結果皆呈現(xiàn)陰性(表 1)，顯示 I-VTM 可以去除病毒活性(感染力)。同時觀察將 EV 71 保存于 I-VTM 中于三種不同時間點 (4C、 室溫及 -80C)保存 10 分鐘、30 分 鐘、1、2、3 及 4 小時，結果顯示 4C及室溫 于 2 個小時可以完全去除 EV 71，而-80C僅 需 30 分鐘即可(表 2 與圖 3)。

 

VTM/I-VTM 在不同溫度及時間下保存 EV  71及 COVI-19 病毒核酸的狀況

在臨床檢驗中，由于檢體采集包含組織、 疲液、血液及糞便等不同樣本，為了確保 VTM 及 I-VTM 能直接保存核酸樣本，將 EV 71 與 SARS-CoV-2 檢測所用的 E、RdRp 及 N基因片段加入 VTM 及 I-VTM 中于 4C、室 溫及-80C各別保存 24 及 96 小時，利用 qRT- PCR 檢測 EV 71 核酸及 SARS-CoV-2 基因的 訊號。結果顯示 VTM 及 I-VTM 至少可保存 病毒核酸至 96 小時(表 3)。

 

討    論

 

自患者檢體中分離病毒的方法為病毒疾 病診斷法之一。含有液體的檢體，例如腦脊 髓液、尿液、及糞便檢體可直接置于無菌的 容器中送到病毒檢驗室。必須以拭子采集的 檢體如喉嚨、鼻咽、直腸等，則須將采集檢 體后的拭子立刻放入無菌的運送培養(yǎng)基中。 病毒檢體運送培養(yǎng)基至少具有三個功能[11]: (i)提供給水分，防止干燥將病毒去活化(inac- tivated)。(ii) 含 有 蛋 白 質(zhì) 穩(wěn) 定 劑 (protein stabilizer) 以保持拭子上病毒的活性。以及 (iii)含有抗生素而可抑制采檢時受到采檢部 位棲息細菌和其菌的污染。無論是否使用運 送培養(yǎng)基裝置，所有的檢體須立刻送到檢驗 室，因為病毒在活細胞外十分不穩(wěn)定。

冠狀病毒中 SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 都是屬于傳染力極強的飛沫傳染病毒，感染 者都會伴隨著嚴重的呼吸道癥狀及高致死率 前者于 2002-2003 共造成全球 8,096 例感染， 其中 774 例死亡，致死率為  9.56%;而后者 于 2019-2020/9 月中共造成全球 3,131 萬人感 染，其中 96.6 萬人死亡，致死率為 3.09% [12]，且兩種病毒有最長 10 及 14 天的高感染 力潛伏期。面對傳播如此快速又高致死率的 病毒，臨床上有效且安全地篩檢 COVID-19 確診患者將是一項重大的考驗。

病毒的聚合醋 鏈反應 (PCR)檢測，不能 含有外來的 DNA/RNA 及 DNases/RNases， 但棉拭和海藻酸鹽棉拭均存在這些醋，將會 抑制 PCR 反應[3]。VTM 或 I-VTM 所附帶的 拭子均為植絨的吸頭，其為聚瞌胺的一種， 植絨纖維束間的毛細管作用促進了液體樣品

 

(A) CMPTM 病毒運送保存管[viral transport medium (VTM，左方橘色培養(yǎng)液)]與 CMPTM 去活化型病毒運送保存 管[inactivated viral transport medium (I-VTM，右方透明培養(yǎng)液)]，兩者皆可搭配鼻咽及/或口咽植絨拭子(flocked swab);(B)由上到下分別為 nasopharyngeal flocked swab(鼻咽植絨拭子)、oropharyngeal flocked swab(口咽植 絨拭子)及一般人造絲棉棒。植絨拭子皆具有斷點(紅色箭頭處)，可將拭子前端折進運送管內(nèi)。

 

表 1. EV 71 分別接種于 VTM 或 I-VTM 中在不同溫度及儲存時間下對 RD 細胞產(chǎn)生 CPE 及 RD

細胞內(nèi)核酸檢測結果

于存溫度/于存時間

Control(控制組)

4C

RT

-80C

Medium only

EV 71 only

6 hr

24 hr

48 hr

72 hr

96 hr

48 hr

72 hr

96 hr

48 hr

72 hr

96 hr

測試產(chǎn)品

VTM

CPEa

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Positive strandb

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Negative strandC

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

測試產(chǎn)品

I-VTM

CPEa

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Positive strandb

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Negative strandC

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

aCPE: +，代表 RD 細胞產(chǎn)生細胞病變 (CPE); -，代表 RD 細胞無 CPE;bPositive strand: +，表示樣品中含有 EV 71 顆粒。-， 表示樣品中無 EV 71 顆粒;CNegative strand: +，代表 EV 71 核酸進行復制; -，代表 EV 71 核酸無進行復制。 縮寫:VTM，病毒運送保存管;I-VTM  去活化型病毒運送保存管;RT，室溫。

的強力吸收，且將樣品吸附在靠近表面的位 置，因此，易再溶于液體中。因此，植絨拭 子可有效收集和釋放包括細胞在內(nèi)的顆粒物 [13]，適合采檢含有病毒的檢體[1-3]。適當?shù)倪\ 送培養(yǎng)基的組成對保護檢體中病毒免受環(huán)境損傷，維持病毒活性極其重要[11]。實際上，病毒的傳染性會隨著時間的流逝而降低，且衰減率通常與于存溫度有關[14]，藉由冷藏可 維持其核酸穩(wěn)定性。采集含有較多病毒顆粒 的細胞培養(yǎng)物及縮短病毒檢體的運送與接種 時間，將會增加成功分離病毒的可能性，此 對高危險性傳染病毒的精準診斷將有所幫助。

本研究將 EV 71 保存于 VTM 中，結果發(fā)現(xiàn)無論是 4C、室溫及-80C保存于指定時間點

 

 圖 2. EV 71 分別接種于 VTM 或 I-VTM 中在不同溫度及時間財存后戚染 RD 細胞所顯示的細胞形態(tài)

圖中包括含陽性控制組(PC: virus)、陰性控制組(NC: medium)與實驗組(4C、RT 及-80C)之細胞形態(tài)。顯微鏡 (200x)觀察。(A) VTM 的陰性控制組顯示細胞完整，無細胞病變(CPE);陽性控制組與實驗組在所有溫度及時間下 皆發(fā)現(xiàn) CPE:細胞呈現(xiàn)皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、凝聚、和脫落等現(xiàn)象(箭頭)。(B) I-VTM 的陰性控制組與實驗組 細胞皆無 CPE，而陽性控制組則有 CPE。

縮寫:VTM，病毒運送保存管;I-VTM   去活化型病毒運送保存管;RT，室溫。

后(最久 96 小時)接種于 RD 細胞，結果顯 示 RD 細胞皆呈現(xiàn) CPE;此外，檢測細胞內(nèi)正股及負股 RNA 亦皆呈現(xiàn)陽性，顯示 VTM 可

以良好保存病毒活性(表 1  和圖  2A)。當 EV 71 保存于 I-VTM 中，無論是 4C、室溫及-80C 保存于指定時間點后接種于 RD 細胞，結果顯 示細胞皆無呈現(xiàn) CPE，細胞內(nèi)的 EV 71 正股及 負股 RNA 亦皆呈現(xiàn)陰性(表 1 與圖 2B)，此 指出 EV 71 喪失活性。另外研究亦指出 I-VTM 可于 2 小時完整的去除 EV 71 活性(表 2 和圖 3)。此外，將 EV   71 與 SARS-CoV-2 的片段

 

表 2.  接種 EV 71 于 I-VTM 在不同溫度下時 存不同時間裂解病毒(不產(chǎn)生  CPE)的效能

時間 溫度	10 min	30 min	1 hr	2 hr	3 hr	4 hr
4C	+*	+	+	-	-	-
RT	+	+	+	-	-	-
-80C	+	-	-	-	-	-

*+，表示接種到 RD 細胞后于 72 小時內(nèi)出現(xiàn)細胞病變

(CPE);-，表示未出現(xiàn) CPE。

縮寫:I-VTM  去活化型病毒運送保存管;RT，室溫。

圖 3. 接種 EV 71 于 I-VTM 中儲存不同溫度 及不同時間后分別移種 RD 細胞所顯示 EV 71 不產(chǎn)生 CPE(喪失活性)的情形

圖中包括含陽性控制組 (PC: virus)、陰性控制組 (NC: medium)與實驗組 (4C、RT 及-80C)之細胞形態(tài)。顯 微鏡 (200x)觀察，箭頭代表產(chǎn)生 CPE 細胞。結果顯示 控制組細胞完整無 CPE，而實驗組中于存在-80C，1 小時后以及于存在 4C及 RT(室溫)，2 小時后完全 無 CPE(代表 EV  71 喪失活性)。

縮寫:I-VTM 去活化型病毒運送保存管;RT，室溫。

表 3.  VTM 與 I-VTM 在不同溫度下保存 EV  71 及 SARS-CoV 2 核酸情形

 

時間 溫度	EV 71 RNA				SARS-CoV 2 基因片段 (E gene、RdRp gene 及 N gene)
	VTM		I-VTM		VTM		I-VTM
4C	24 hr	96 hr	24 hr	96 hr	24 hr	96 hr	24 hr	96 hr
4C	+	+	+	+	+	+	+	+
RT	+	+	+	+	+	+	+	+
-80C	+	+	+	+	+	+	+	+

+，表示樣品中含 EV 71 或 SARS-CoV-2 核酸，可被 qRT-PCR 檢出。

 

縮寫:VTM，病毒運送保存管;I-VTM   去活化型病毒運送保存管;RT，室溫。

 

基因直接加入 VTM/I-VTM 中于 4C、室溫 及-80C保存 24 及 96 小時，然后進行兩種病 毒的核酸偵測，結果皆為陽性，指出   VTM/I-

 

VTM 皆可完整保存病毒的核酸(表 3)。

 

上述結果顯示 VTM 或 I-VTM 不論在 4C、室溫及-80C皆可以在指定時間內(nèi)有效 保存病毒的可檢測性，其中 VTM 為保存型 運送管，可以完整保存病毒的活性，以利后續(xù)的體外活體細胞培養(yǎng)、抗原檢測、核酸檢測.等鑒定及研究用途，而 I-VTM 的特點則 在于運送過程中(2 小時)即可裂解病毒顆 粒，僅保存核酸供作核酸檢測，而不具感染 能力，其設計目的為增加臨床第一線檢測人 員的安全，降低感染風險。根據(jù)本研究所獲 得的數(shù)據(jù)顯示，做新生物科技有限公司生產(chǎn) 的 VTM 及 I-VTM 可做為臨床檢驗室選用病 毒檢體運送裝置的參考

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